暗視野顯微鏡的原理是利用丁達爾光學效應的原理，在普通光學顯微鏡的結構基礎上改造而成的。暗視野聚光器，使光源的中央光束被阻擋。不能由下而上地通過標本進入物鏡。從而使光改變途徑，傾斜地照射在觀察的標本上，標本遇光發(fā)生反射或散射，散射的光線投入物鏡內， 因而整個視野是黑暗的。而具體的原理如下：

丁達爾效應是指當一束光線透過黑暗的房間，從垂直于入射光的方向可以觀察到空氣里出現(xiàn)的一條光亮的灰塵“通路”，這就是所謂的丁達爾效應。而暗視野顯微鏡就是利用此原理，在普通的光學顯微鏡上換裝暗視野聚光鏡后，由于該聚光器內部拋物面結構的遮擋,照射在待檢物體表面的光線不能直接進入物鏡和目鏡，僅散射光能通過,因而暗視野顯微鏡視野是黑暗的。

因為暗視野顯微鏡由于不將透明光射入直接觀察系統(tǒng)，無物體時，視野暗黑不可能觀察到任何物體，而當有物體時，以物體衍射回的光與散射光等在暗的背景中明亮可見。在暗視野觀察物體，照明光大部分被折回，由于物體所在的位置結構，厚度不同，光的散射性，折光等都有很大的變化。

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